前
言
无论是新药还是仿制药中，手性化合物可谓使形影不离我们药物研发的整个过程，互为对映异构体的两个化合物往往在药理，药效的实验过程中，会表现出对生命体征的明显差异，因此在药物的质量标准中，确定单一有效构型的含量显得尤为重要，如何对其异构体进行准确的定量，涉及到手性物质的方法开发，手性物质的方法开发和有关物质的方法开发略有差异，表现在分离原理，色谱柱选择，流动体系的选择上面，今天我们来聊聊手性方法开发的小经验，若有不同，欢迎指教。
一. 手性化合物性质
手性方法的开发的研究，离不开对手性化合物性质的了解，只有对手性物质的性质足够了解，才会对分离原理有所掌握、对分析方法有所延展，下面就手性化合物的性质进行简单的表述：
1）名称的由来：何为手性化合物，顾名思义，像我们的双手一样可互相对映却又不可以完全重叠，与之构型不同的化合物互为镜像的关系。
2）如何判断是否为手性化合物：空间结构是否具有对称性，用于判断对称性的参数有对称中心，对称轴，对称面，和交替对称轴，其中对称轴的有无对分子是否具有手性没有关键性的影响，而凡具有对称中心，对称面和交替对称轴的化合物都可以与其镜像重合，均为非手性分子，反之，则为手性分子。但是平时的工作中还有一个简单的判断分子是否具有手性方法，那就是手性碳原子的存在，一个碳原子上连着四个互不相同的基团，空间上有两种不同的排列结构，这样的碳原子为手性碳原子，凡是具有手性的化合物一定具有手性碳原子，但是反之，不成立，若是一个化合物具有两个手性中心，那么此化合物不一定为手性化合物，可能为内消旋体。
3）手性化合物的性质差异：物理性质方面来说，互为对映异构体的化合物分子量，熔点，沸点，相对密度，折光率，溶解度，光谱均没有任何的差异，物理性质的差异表现在可以使偏振光的振动方向发生偏转，称为旋光性，互为对映异构体的化合物的旋光方向相反，但强度相同，若 R 构型化合物为右旋 25°，那么 S 型化合物为左旋 25°。
化学性质方面，除了在手性试剂中表现出的化学选择性方面的不同以外，其他的化学性质均相同。
二. 手性分析方法开发的类型
1 手性衍生方法开发
手性化合物与手性衍生试剂反应，使得一种构型与其对映异构体产生物理性质的差异，从而可以在反向色谱上根据分配比的不同实现手性异构体的分离。此种方法随着手性固定相的开发，占据的优势越来越小。
2 手性色谱柱
手性色谱柱是讲手性固定相与色谱填料结合在一起，通过固定相与化合物之间作用力的差别来实现对映异构体的分离，现在手性色谱固定相有了越来越多的种类，因此目前大部分的手性分离的方法是用手性色谱柱进行分离。
3 手性试剂流动相添加法
将手性试剂加入到流动相中，在洗脱过程中，手性试剂与对映异构体结合，形成非对映异构体，从而实现在固定相中保留时间的差异，达到分离的目的。
三. 手性色谱柱分类
目前市场上所售的手性色谱柱的类型有哪几类，根据固定相的不同，我在这里做一个简单的概括：
1）多糖类衍生物固定相色谱柱：此类化合物的固定相为纤维素衍生物和直链淀粉衍生物，适用于含有酰胺基、芳香环取代基、羰基硝基、磺酰基、氰基、羟基、氨基，以及氨基衍生物等的化合物。
1）冠醚类手性色谱柱：固定相为冠醚类手性固定相，主要分离氨基酸及手性中心有胺基的化合物。
2）蛋白质类手性色谱柱：固定相为特定酶类蛋白质，主要分离苯环结构的伯胺和仲胺的化合物，用于反相色谱。
3）环糊精类色谱柱：目前日本 YMC 公司主要是α、β、γ三种类型环糊精衍生物的色谱柱。
4）其他色谱柱：离子交换色谱柱，配基交换色谱柱，同样用于氨基酸及其衍生物的对映异构体的分离。
上述的色谱柱的应用范围最广的当属多糖类衍生物的色谱柱，可以分离的手性化合物占有 80%以上，其于针对不能用多糖类衍生物分离的化合物，或者用多糖类衍生物色谱柱分离效果不好的化合物。
四. 手性分离原理
市场上这么多类的手性色谱柱，是什么原理，基于什么作用力将对映异构体如此双胞胎的化合物得到了完美的分离，答案是色谱柱对于所分离的化合物具有良好的空间选择性和空间作用力，手性色谱柱的分离原理是将具有光学活性的单体固定在硅胶或其他聚合物上制成手性固定相，通过引入手性环境使的对映异构体呈现物理特征的差异，从而达到光学异构体拆分的目的，而要实现这种手性分离，我们的化合物和手性固定相之间至少需要存在三种相互作用力，这三种相互作用力包括氢键作用，偶极-偶极作用，Π-Π作用，静电作用，疏水作用，或者空间包埋，这些相互作用力会影响包分离的结果，就这些作用力进行简单的介绍。
1 1 ）包含作用（空间包埋）：不论是哪类的固定相，都存在一定的空间构型，而固定相的空间结构可形成选择性腔体，被分离的化合物尤其是苯环等环形化合物由于空间结构可被包含于腔体内，形成包埋复合物，从而增强固定相和化合物之间的作用力，而异构体由于空间构型的不同，作用力的强弱之差形成对映异构体的分离。
2 2 ）氢键作用：O-H 和 N-H 之间，及 F-H 之间的作用力称为氢键作用力，氢键作用力是分子间较强的作用力，主要存在于衍生配体与化合物之间，所以，若是被分离的化合物的结构中含有羰基，羟基，酯，酰胺，胺类等官能团时，氢键就起到不可缺少的作用。
3 3 ）Π- Π相互作用：苯环的结构之所以这么稳定主要的作用的形成了大Π键，每个碳原子最外层的电子紧密的结合在一起形成电子云使得结构稳定，Π-Π作用是基于苯环稳定的结构之上，若是苯环上一个 H 被甲基取代，形成Π碱，另一个苯环上的 H 被硝基取代，形成Π酸，那么这两者之间形成了酸碱之间的Π-Π堆叠的强大作用力，构成异构体分离的差异。
4 4 ）疏水作用力：此作用力，主要用于蛋白质类色谱柱的手性分离中，疏水作用力主要存在于非极性基团和水之间，通常在反相中进行对映异构体的分离。
5 5 ）偶极- 偶极作用力：偶极-偶极相互作用是极性分子间最普遍的一种相互作用，即一个极性分子带有部分正电荷的一端与另一分子带有部分负电荷的一端之间的吸引作用。
用于手性分离的色谱柱和化合物之间主要是这几种作用力，根据化合物的所连接的基团的不同，形成的作用力的大小，种类也不相同，所以对于不同类型的化合物进行手性分离时，首先选用适合的色谱柱。
五. 手性方法分离优化
而针对药物研发中小分子化合物的手性分离，既不是氨基酸，也不是蛋白质大分子，最多采用的色谱柱为多糖衍生类色谱柱，此类手性柱应用广泛，可分离的化合物的种类多，因此就这一类的色谱方法开发的几个重要的因素进行表述：
第一，色谱柱的选择
多糖衍生类色谱柱固定相主要分为：纤维素衍生物和直链淀粉衍生物，就其空间结构来讲，两者均是形成螺旋型腔体，使得空间结构对于化合物有包含作用力，但是直链淀粉的空间结构比纤维素的空间结构要大一些，因此作用力稍强一些，因此在选择色谱柱的基础上，会首先建议选用直链淀粉类色谱柱；再者，目前手性色谱柱做的比较好的公司，日本大赛路，此公司的多糖类衍生物的色谱柱又分为了键合型和涂敷型两种，就色谱柱的使用寿命和耐用性方面，首选键合固定相，键合类色谱柱不容易发生柱流失，而且对于流动相体系的可选用范围有很大的空间。
第二，流动相体系的选择
流动相的体系的选用是与固定相之间形成一个竞争机制，使得在流动相的洗脱下对映异构体得到分离；选定色谱柱以后，那么可选用的溶剂的种类有了一个范围，在色谱柱溶剂使用的范围内进行流动相体系的依次筛选，在筛选的初步，首先使用常规流动相，例如正己烷，正庚烷，异丙醇，乙醇等的流动相，再者，选用非常规的流动体系，二氯甲烷，乙酸乙酯等；再选定了流动相以后，再进行等度比例得筛选，在正向色谱中由于基线漂移问题，首先选用等度洗脱，再依次调节适合的流动相比例，正相中一般不采用梯度，梯度洗脱基线变化非常大，容易出现不明峰。
第三，色谱参数的调节
1 1 ）流速的调节上，通常色谱柱会提供一个建议流速，例如 1ml/min，但有时在此条件下分离度不够，那么可以降低流速使得分离度合格；
2 2 ）柱温的调节，通常条件下，低温有利于分离，因为低温下传质阻力减弱，流动相的粘度增大，更有利于异构体分离，但是也有例外情况，有的化合物对温度敏感的，柱温对分离的影响大些，反之，小些，
3 ）波长的选定，手性方法开发中，波长的选用相对有关物质开发来说较为简单，选择的标准是吸光度相同，且该波长下吸光度稳定，则方法的耐用性良好，满足这两个条件的物质的会选用化合物最大吸收波长，但是若是方法中使用了添加剂，那么波长的选用应大于添加剂的截止波长，避免基线影响检测。
4 4 ）浓度选定：根据选定波长下的异构体的峰高和峰宽情况，确定检测的灵敏度，进而确定测定浓度。
色谱参数的调节需要我们的研发工作者针对不同化合物进行独立探讨和实验，最后确定最终的参数。
六.手性方法开发小建议
1 1 ，避免固定思维
对于刚开始入门的所有的分析人员来说，可能希望找到一种模式，来使得针对所有的化合物有效，比如，低温一定有助于分离，异丙醇一定比乙醇的体系分离度好，此类等等，但是凡是均有例外，所以需要尝试摸索不能盖棺定论，应具体化合物具体分析。
2 2 ，添加剂
酸性添加剂和碱性添加剂，加入添加剂的目的有两个：第一，有效改善峰形，色谱的硅胶填料性质决定了加入碱性添加剂，可以起到扫尾的作用；第二：PH 的作用，可以改善样品在溶剂中官能团的解离。
那么如何选择酸碱添加剂：1，碱性化合物首选碱性添加剂，例如三乙胺 、二乙胺等，添加碱性添加剂可以有效地防止化合物和硅羟基之间的相互作用而引起的拖尾现象；2，酸性化合物首选酸性添加剂：例如三氟乙酸，醋酸等，多糖衍生类固定相的极性较大，酸性化合物有可能与固定相结合，从而导致色谱峰洗脱不出来，或者峰形严重拖尾，加入酸性试剂可以有效的抑制化合物的解离，实现化合物的分离。
但是色谱柱都有 PH 的耐受上限，因此每一款不同的色谱柱的适用说明说上都有最高的添加量，比如大赛路的色谱柱DEA 最高 0.5% 三氟乙酸 0.5%最高，若是适用使超过上限会对色谱柱的寿命有很大影响。
3 3 ，流动相选择
因多糖类衍生物可以在水中和卤代烷烃中溶解，手性方法中避免使用这一类的溶剂，特殊处理工艺的色谱柱除外，所以常规条件的流动相多选用烷烃，和醇类，在正相色谱中，固定相为极性较大的化合物，那么醇类在洗脱剂中为强洗脱性溶剂，而烷烃类为弱洗脱性溶剂，首选正己烷和乙醇进行方法开发，这一组体系不能将化合物进行分离，将乙醇更改为异丙醇或者正丙醇，或者将正己烷改为正庚烷，可能会有很大的改善，也可能效果不明显，每一种化合物和溶剂之间的相互作用需要不断的尝试。
4 4 ，矛盾解决
在整体的研发中，可能会遇到相互矛盾的情况出现，例如，异构体的分离度不够，流动相中增高烷烃的比例，分离度合格了，该浓度下的灵敏度的信噪比太小，灵敏度和分离度之间形成了矛盾，此时尝试柱温的改变和流动体系的改变来满足我们分离的要求。
在我们的实验室若是不能提供很多的色谱柱的情况下，而项目时间紧张的情况下，送到特定的手性公司，例如大赛路，日本 YMC 进行方法摸索可以省时省力，也不失为一个便捷的方法，手性方法开发中的小知识就先分享这些，主要是一些基础的原理和方法开发一些小知识，欢迎大家一起来探讨学习。
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